di
Enzo Grossi* Silvio Cavuto**

* Centro Diagnostico Italiano, Milano
** Registro Tumori ed Epidemiologia Ambientale, Istituto Nazionale dei Tumori, Milano

La nozione di età biologica e il suo rapporto con le teorie dell'invecchiamento

Negli ultimi anni, con la ripresa di interesse verso gli aspetti medici e scientifici alla base dell'invecchiamento e alla possibilità di rallentarlo attraverso interventi farmacologici mirati, il concetto di età biologica è diventato un argomento di conversazione di grande attualità.
Ecco che, in rapporto alla crescente sofisticazione della domanda di salute da parte dell'uomo della strada, dalle domande: Ho qualche malattia nascosta? Sono a rischio per qualche malattia? Come posso fare per restare in buona salute? Si è passati a: Qual è la mia età biologica? Invecchierò bene? Posso ringiovanire?

La cosiddetta età biologica è un concetto utilizzato frequentemente ma in modo spesso vago ed improprio e con scarsa obiettività per descrivere una differenza tra la spettanza di vita media di una coorte di individui nati in uno stesso anno e la spettanza di vita percepita di un individuo della stessa età.

Come si può stabilire l'età biologica di una persona? In generale l'impressione immediata ricavata dall'aspetto del volto ci rende in grado di giudicare se una certa persona "è più giovane" o "più vecchia" rispetto alla propria età anagrafica.
Secondo alcuni autori la percezione dell'età di un soggetto o delle sue caratteristiche avviene in maniera apparentemente automatica, ma è in effetti una conseguenza dei fenomeni di apprendimento legati a circuiti sensoriali, mentali, cinestesici, ai quali si aggiungono credenze, pensieri ed emozioni..

D'altra parte è nozione comune che capire l'età di una persona guardandola in volto non sempre può essere facile. Quasi inevitabilmente si deve ricorrere all'uso di rilevazioni più a meno sofisticate di indici fisiologici per i quali siano disponibili ampie basi statistiche nella popolazione generale. Per sgombrare subito il campo da possibili equivoci dobbiamo affermare che al momento non è stato definito nessun metodo standardizzato e generalmente accettato per quantificare l'età biologica.

Solo per determinati compartimenti dell'organismo attualmente disponiamo di sofisticate metodiche strumentali di diagnostica non invasiva che consentono, attraverso l'uso di specifici modelli matematici di riferimento, di determinare l'età biologica. Un caso tipico è quello dell'età biologica cutanea per la quale sono state sviluppate tecniche sofisticate basate su torsiometria, spettrofotometria e analisi d'immagine del microrilievo cutaneo. Quando invece ci riferiamo all'età biologica in senso più globale, allora emergono enormi problemi di tipo metodologico. Se questa quantificazione si rivelasse possibile, il suo utilizzo rivestirebbe un indubbio valore, per esempio per coadiuvare la presa di decisioni informate sulla appropriatezza di procedure invasive o di interventi chirurgici, con minor ricorso a criteri di mera soggettività, o per dare all'individuo un parametro che gli consenta di proiettare in maniera attendibile la propria qualità di vita o addirittura la propria spettanza di vita.

L'incapacità di predire la spettanza di vita nel singolo individuo non ha interferito con la creazione del concetto di età biologica, anche se il termine è stato talvolta utilizzato in maniera soggettiva, con la complicazione che un paziente sembra più vecchio o più giovane rispetto alla sua età.

L'invecchiamento si può considerare come un processo multifattoriale, che deriva dalla interazione di fattori genetici, ambientali e abitudini di vita. Nel corso del tempo moltissimi studi sono stati indirizzati all'identificazione degli eventi biologici a cui potrebbe essere imputabile il deterioramento progressivo che si verifica in concomitanza con l'invecchiamento. Attualmente una delle teorie maggiormente accreditate ipotizza che esista un meccanismo comune alla base di numerose patologie associate all' invecchiamento che colpiscono organi diversi.
Questa teoria è incentrata sul ruolo primario svolto dai radicali liberi e fornisce un modello plausibile e generale per spiegare il processo dell'invecchiamento.

La premessa iniziale di tale teoria è che l'invecchiamento e le malattie ad esso correlate siano la conseguenza di danni indotti dal fenomeno dello stress ossidativo. Questo processo è associato ad uno sbilanciamento fra l'eccessiva produzione di fattori ossidanti (quali i radicali liberi) e la diminuzione delle difese antiossidanti, che alla fine si manifesta sotto forma di danno per l'organismo.( Farber et al., 1990)

Secondo le più moderne teorie l'invecchiamento è caratterizzato da uno stato di infiammazione cronica lieve legato sia alla predisposizione genetica innata che ad alterazioni del patrimonio genetico acquisite da ogni individuo nel corso della propria vita per ragioni stocastiche e/o ambientali. Questo tipo di processo infiammatorio può condurre, alla lunga, alla compromissione di organi e apparati quindi alla riduzione della longevità, incrementando la sensibilità ad alcuni fattori rischio. Le malattie correlate all'età, come la malattia di Alzheimer, la malattia di Parkinson, l'aterosclerosi, il diabete di tipo 2, l'osteoporosi, possono iniziare a manifestarsi o essere amplificate dall'infiammazione. Per questo motivo lo studio dell'infiammazione, in particolare dell'alterazione nella produzione delle citochine che regolano questo processo, rappresenta una frontiera ancora poco esplorata ma molto promettente.

Tecniche di stima dell'età biologica mediante algoritmi matematico-statistici

La difficoltà insite nella determinazione dell'età biologica attraverso l'esame diretto e finalizzato del soggetto hanno sollecitato la ricerca di tecniche quantitative che consentissero di pervenire con minor sforzo ad un risultato analogo, almeno dal punto di vista teorico. Quest'ultima precisazione è d'obbligo poiché, coerentemente al canone galileiano, nessun modello matematico, per quanto sofisticato, può sostituirsi all'osservazione diretta della realtà. Poiché non esiste un metodo unico per stimare l'età biologica, può essere utile in prima istanza cercare di operare una classificazione delle principali metodologie disponibili. In linea di principio possiamo dunque distinguere due possibili tipologie di approccio:
1) tecniche che cercano di stimare, sulla base di alcune caratteristiche biologiche dell'individuo, l'età biologica che si avrebbe ricorrendo ad una metodologia basata sull'osservazione diretta del soggetto. Queste tecniche cercano di costruire un algoritmo in grado di imitare nel miglior modo possibile il processo di attribuzione dell'età biologica che farebbe un essere umano seguendo una procedura empirica come quelle codificate dalla medicina legale. Questo genere di tecniche, non sono in genere corredate di strumenti atti a saggiare la validità dello standard che cercano di replicare. Hanno inoltre il problema che, anche se fosse possibile replicare perfettamente il processo decisionale umano di attribuzione dell'età biologica mediante un procedimento matematico, qualora fosse proprio il processo umano ad essere sbagliato non sarebbe possibile accorgersene..

2) tecniche che presuppongono una definizione del concetto di età biologica, informa matematica o statistica, nei termini di una relazione formale con altre caratteristiche biologiche di diretta e possibilmente facile misurazione nell'individuo. Poiché tale relazione viene assunta come nota solo in alcuni suoi aspetti, secondo questo approccio sarà prima necessario utilizzare i dati rilevati su un grande numero di individui per precisare la natura di questa relazione, quindi utilizzare la formula matematica così definita per l'attribuzione dell'età biologica di un individuo sulla base delle caratteristiche biologiche che sono state considerate rilevanti ai fini della sua definizione.

La validazione delle tecniche di stima dell'età biologica

Le tecniche che cercano di stimare l'età biologica seguendo il primo approccio sono caratterizzate da minori problematiche di validazione. Infatti, è sufficiente prendere un gruppo di individui indipendente da quello che è stato utilizzato per la costruzione del metodo in validazione, stimare per tali soggetti l'età biologica e confrontarla con quella "vera". Benché questo metodo di validazione possa nascondere sottili insidie di carattere statistico, prima tra tutte quella legata alla rappresentatività del campione di validazione e quindi alla generalizzabilità dei risultati, appare indubbiamente dotato di una sua intrinseca e auto-evidente validità. Inoltre, se opportunamente condotto, consente di acquisire informazioni utili per migliorare il metodo di stima.

Diverso è invece il processo di validazione per tecniche del secondo tipo. In questo caso, infatti, l'età biologica viene direttamente definita in termini matematici cercando di ottimizzare un particolare criterio dotato di un razionale generalmente spiegato dal campo applicativo nel quale si vuole poi utilizzare l'età stimata. In questi casi, quindi, si tratta di verificare in che misura l'algoritmo di stima è stato in grado di ottimizzare il criterio adottato, essendo il suo razionale assunto come valido a priori. Il metodo di validazione è molto diverso dal caso precedente poiché queste tecniche non si pongono l'obiettivo di stimare un dato che pre-esiste ad esse, ma cercano invece di soddisfare al meglio, sulla base della realtà empirica, un preciso criterio di ottimalità teorica dettato dalla specifica applicazione per la quale viene costruito il modello: la validazione si riduce quindi a constatare quanto queste tecniche siano in grado di estrarre dai dati reali un'informazione che può essere interpretata in termini di età biologica secondo canoni definiti a priori in termini astratti.

Panoramica sugli algoritmi di calcolo per l'età biologica

Per quanto concerne l'approccio di primo tipo, il problema si riduce "semplicemente" nella costruzione di un algoritmo in grado di replicare le performance di un decisore umano sulla base di un campione di individui che sia rappresentativo della popolazione di soggetti a cui si vorrà poi applicare l'algoritmo. Per ciascuno di questi individui, quindi, dovrà essere disponibile l'età biologica attribuita dal decisore umano e una serie di variabili entro le quali scegliere quelle più adatta per la costruzione di un modello predittivo. La generalizzabilità dei risultati dovrebbe essere garantita, sul piano statistico, dall'applicazione di specifici schemi di campionamento basati su meccanismi casuali che impediscano, almeno in termini probabilistici, di costruire un modello non estendibile a soggetti diversi da quelli entrati nel campione. Questo aspetto è quindi estraneo all'algoritmo predittivo in sé, per il quale si assume che la rappresentatività del campione utilizzato per la sua costruzione sia stata opportunamente assicurata da opportune prassi di selezione degli individui. Riguardo alla scelta dell'algoritmo non esiste invece che l'imbarazzo della scelta. Alle tecniche di regressione di origine statistica si possono infatti affiancare metodologie come le reti neurali che vedono la loro genesi in diversi contesti teorici, più che applicativi, o soluzioni ibride che attingono da presidi metodologici distinti ma che possono essere opportunamente integrati in funzione della loro complementarità. Un caso molto classico è quello del ricorso ad opportune tecniche statistiche a supporto della costruzione i modelli neurali (vedi ad es. Davino, 2002). Il quadro può essere poi completato da algoritmi ancora più sofisticati come la Support Vector Regression (Drucker et al, 1997), i regression trees (Breiman et al., 1984), le tecniche basate su intere popolazioni (ensambles) di modelli previsivi in luogo di uno solo, come il bagging (Breiman, 1996) o il boosting (Schapire, 1990).

La situazione è invece molto diversa e più eterogenea per l'approccio di secondo tipo, per cui ci limiteremo ad indicare sommariamente solo alcune esperienze che riteniamo particolarmente rappresentative di questa seconda modalità e utili per introdurre il nostro algoritmo di calcolo.

Una soluzione ben caratterizzata secondo le linee proprie del secondo approccio è quella descritta in Jackson et al., 2003. Basandosi sull'osservazione che il valore di laboratorio di molti biomarkers tende a diminuire in modo approssimativamente lineare all'avanzare dell'età anagrafica, questi autori hanno costruito un sistema di determinazione dell'età biologica basato su semplici modelli di regressione lineare costruiti a partire dai dati relativi a 16 biomarkers. Questa tecnica non solo consente di stimare l'età biologica, ma prima ancora ne da un'implicita definizione che consegue dalla particolare relazione statistica individuata tra età anagrafica, età biologica e valore dei biomarkers selezionati, come è caratteristico degli approcci del secondo tipo. Lo studio in questione trova il suo interesse non tanto nell'impiego della regressione, quanto nel suo uso secondo modalità tecnicamente non banali e nella costruzione molto lucida del razionale sulla cui base viene costruito il modello proposto, con rimandi ai lavori molto suggestivi di Weale, 1997 e Richter, 1995.

Per un lavoro più classico tra quelli che utilizzano tecniche di regressione, invece, si può ricordare senz'altro Furukawa et al., 1975.

Le ricerche più sopra citate sono particolarmente significative dal nostro punto di vista, poiché anche nel nostro algoritmo di calcolo si fa largo uso di modelli di regressione. Riguardo a Jackson et al., 2003, inoltre, molto rilevante ai nostri occhi appare la condizione ivi espressa che i biomarkers siano determinati su persone sane ai fini della costruzione del modello, poiché lo stato di salute gioca un ruolo determinante nel nostro algoritmo.

Strettamente connesse alle esperienze strutturate attorno ai modelli di regressione sono diverse ricerche basate su misure di correlazione, poiché attengono ad un contesto affine e in molti casi prodromico a quello della regressione. Tra le più interessanti possiamo citare: Hollingsworth et al., 1965, Nette et al., 1984 e Rivnay et el., 1980.
Indagini molto complesse dal punto di vista della metodologia statistica sono state basate su tecniche di analisi dei fattori e altre metodologie da essa derivate. In questo ambito, lo studio più famoso e sofisticato è, a nostro giudizio, Nakamura & Miyao, 2003, basato in larga parte sulla metodologia LISREL (Joreskog & Sorom, 1983), che può essere considerata una sorta di generalizzazione della comune analisi dei fattori. In questa ricerca viene fatta un'indagine molto accurata sulla base di 9 biomarkers selezionati da un gruppo di 25, volta più a chiarire la trama di relazioni intercorrenti tra queste misure e il concetto di età biologica che non limitarsi alla sua semplice quantificazione, che in realtà non è tra gli scopi dichiarati del lavoro ma che può essere ricavata dal modello ottenuto. La tabella 1 descrive gli indici di correlazione ottenuti da queste 9 variabili fisiologiche.

Questi autori avevano pubblicato un precedente lavoro più semplice sul piano metodologico ma sempre basato su un particolare tipo di analisi dei fattori (Nakamura et al., 1988), seguito dal più complesso Nakamura, 1991, che si collocano lungo una tradizione in cui si ritrova il classico Hofecker et al, 1980, e, prima ancora, le ormai pionieristiche ricerche di Clark, 1960 e Jalavisto & Makkonen, 1963.

L'algoritmo REALAGE: considerazioni introduttive

REALAGE è un algoritmo sviluppato dal Centro Diagnostico Italiano per il calcolo dell'età biologica, la cui impostazione ricalca appieno quella del secondo approccio più sopra descritto. Più precisamente, vengono opportunamente utilizzati modelli di regressione lineare applicati a biomarkers studiati nell'ambito del progetto REALAB (Grossi et al., 2005).

A causa dello stretto legame con il progetto REALAB, da cui non a caso trae il nome, riteniamo utile fornire qualche elemento concernente tale studio. REALAB è un progetto nato e condotto presso il Centro Diagnostico Italiano (CDI), un grande laboratorio privato italiano di analisi cliniche situato a Milano. Il progetto si poneva come obiettivo quello di ridefinire i limiti di riferimento per una serie di 36 analisi cliniche routinarie, suddivisi in 23 esami di base e 13 aggiuntivi (tabella 2), sulla base di dati raccolti nel corso della normale attività quotidiana del laboratorio. Il primo elemento di interesse, quindi, risiede nel tentativo di individuare i limiti di riferimento senza impostare uno studio clinico ad hoc, come ad esempio procedono i produttori di kit analitici al fine di produrre la documentazione descrittiva dei loro prodotti. Più precisamente, l'approccio seguito è quello comunemente definito "a posteriori" nella letteratura di riferimento (PetitClerc & Solberg, 1987). A tale fine, è stato messo a punto un algoritmo multivariato finalizzato all'identificazione dei referti anomali in modo che non venissero considerati nella stima dei nuovi limiti di riferimento. Tale algoritmo rappresenta il secondo elemento di interesse dello studio REALAB, che si colloca per suo tramite lungo una tradizione in cui si ritrovano altri studi che, tentando di risolvere lo stesso problema, presentano alcuni punti in comune con REALAB (ad es.: Kallner et al., 2000, Brinkworth et al., 2004, Schumann & Klauke, 2003). Il terzo elemento di interesse consiste nella notevole dimensione del campione studiato, pari a 166 027 soggetti (maschi = 87 072), essendo questi gli individui che, per almeno uno dei 23 parametri di base studiati (indicati con * in tab. 1), hanno effettuato esami clinici presso il CDI nel periodo 1997-99.

L'algoritmo REALAGE: principio di funzionamento

Alla base dell'algoritmo REALAGE c'è l'idea che l'età biologica di un individuo dovrebbe essere quella alla quale sarebbe considerato sano con i valori che presenta ai suoi esami di laboratorio. Questo razionale presuppone che ci sia un evoluzione caratteristica dei limiti di normalità al variare dell'età per i parametri analitici, o quantomeno per alcuni di essi, fenomeno che è attualmente oggetto di studio da parte del gruppo REALAB e che porterà, a breve, alla definizione dei limiti di normalità calcolati in funzione dell'età del soggetto per i parametri già studiati nel corso della prima fase del progetto (un risultato molto preliminare è riportato in Grossi et al., 2006).

L'algoritmo di calcolo di REALAGE è basato sui 23 esami di base dello studio REALAB, ma come vedremo può essere integrato con ulteriori parametri o riformulato sulla base di parametri diversi, essendo la sua struttura molto flessibile. Si consideri inoltre che non è neppure necessario che, per un soggetto, siano disponibili i valori di tutti i parametri, anche se ovviamente la precisione della stima dell'età biologica sarà tanto migliore quanto maggiore è il loro numero.

Come abbiamo accennato più sopra, per il momento l'algoritmo può essere applicato solo ai maschi. Questa scelta è legata alla possibilità di sfruttare il PSA (che non è stato ovviamente studiato per le femmine).

Ora, per illustrare come funziona l'algoritmo, immaginiamo per semplicità che il calcolo dell'età biologica sia effettuato solo sulla base della glicemia e che interessi una fascia di età compresa tra 20 a 50 anni. Indicando con i un qualunque valore da 20 a 50, si costituisce un insieme di dati costituito dalle glicemie dei soggetti sani di età i e di quelli non sani di tutte le età da 20 a 50 diverse da i. Ad esempio, per i = 42, l'insieme corrispondente sarà costituito dalle glicemie dei sani di 42 anni e da quelle dei non sani di tutte le età da 20 a 50 diverse da 42. Per ciascuno di questi insiemi viene quindi costruito un modello di regressione lineare avente l'età anagrafica del soggetto come variabile dipendente e la glicemia come variabile indipendente. Ognuno di questi modelli, quindi, può essere visto in senso lato come un predittore dell'età anagrafica sulla base della glicemia per i soggetti del gruppo a cui si riferisce.

L'estensione ad un maggiore numero di esami è molto semplice, poiché il processo precedente viene applicato per ogni parametro analitico in modo indipendente dagli altri parametri, quindi le età stimate da ciascun modello di regressione vengono
mediate prima di procedere al confronto con l'età anagrafica al fine di determinare la stima migliore

Validazione dell'algoritmo REALAGE

Utilizzando i 23 parametri del progetto REALAB e applicando rigorosi criteri matematici ai risultati ottenuti da REALAGE, è stato possibile dimostrare che l'età biologica per tutti i soggetti sani coincide con quella anagrafica, mentre questo fenomeno non si verifica mai per i non sani. Più precisamente, al 49% di questi ultimi viene attribuita un'età biologica minore di quella anagrafica, mentre per il 51% viene stimata un'età biologica superiore. Nel primo caso, l'età biologica risulta mediamente inferiore di 11.88 anni, mentre nel secondo mediamente superiore di 19.76 anni. Se si considerano tutti i non sani insieme, l'età biologica risulta mediamente più alta di quella anagrafica di 4.26 anni.

I risultati di validazione, se da un lato appaiono incoraggianti, dall'altro ci spingono a effettuare una ulteriore validazione al di fuori sullo stesso campione utilizzato per sviluppare l'algoritmo come è prassi consolidata nella validazione dei modelli statistici. E' già stata programmata una verifica su dati indipendenti provenienti dall'allargamento del periodo di osservazione sino al 31 dicembre 2006.. Da tale prova ci si attendono importanti indicazioni per una migliore valutazione delle performance dell'algoritmo e per l'introduzione di modifiche in grado di migliorarlo. Da un punto di vista strettamente tecnico verranno valutati modelli di regressione diversi da quelli lineari e si prenderanno in considerazione modalità diverse dalla media aritmetica per la sintesi delle età stimate dai modelli relativi ai diversi parametri analitici. Poiché il progetto REALAB sta attualmente studiando la relazione tra età anagrafica e limiti di riferimento per una vasta gamma di analiti di uso routinario, le indicazioni che emergeranno potranno essere utili per operare una selezione mirata dei parametri analitici da utilizzare per la stima dell'età biologica. Nell'attuale versione di REALAGE, infatti, si sono utilizzati tutti i 23 analisi di base di REALAB, ma in futuro si prevede di limitarsi solo a quelli i cui limiti di normalità mostreranno di essere strettamente connessi con l'età anagrafica, anche al di fuori dei 23 parametri di base. Da ultimo, l'algoritmo verrà ovviamente esteso anche al sesso femminile e verrà allargato l'intervallo di età a cui potrà essere applicato,

Tabella 1. Parametri fisiologici utilizzati per la costruzione del modello predittivo da parte di Nakamura e Miyao.

Tabella 2. Elenco degli esami clinici studiati dal progetto REALAB.
L'asterisco indica gli esami di base.

Figura 1. Flow Chart del progetto REALAB

Riferimenti bibliografici

Breiman, L., Friedman, J.H., Olshen, R.A., and Stone, C.J. (1984). Classification and Regression Trees. Monterey, CA: Wadsworth and Brooks/Cole.

Breiman, L. (1996). "Bagging predictors". Machine Learning, 26:123-140.

Brinkworth R.S.A., Whitham E., Nazeran H. (2004). "Establishment of paediatric biochemical reference intervals", Ann Clin Biochem, 41:321-9.

Clark, J.W. (1960). "The aging dimension: a factorial analysis of individual differences with age on psychological and physiological measurements", J Gerontol, 15:183-187.

Davino, C. (2002). "Metodi statistici per la costruzione e la selezione dei modelli neuronali". Reti neuronali e metodi statistici, a cura di Ingrassia S. e Davino C., Franco Angeli editore, Milano.

Drucker, H., Burges, C.J.C., Kaufman, L., Smola, A., Vapnik, V. (1997). "Support Vector Regression Machines". Advances in Neural Information Processing Systems 9, NIPS 1996, 155-161, MIT Press.

Furukawa, T., Inoue, M., Kajiya, F., Inada, H., Takasugi, S., Fukui, S., Takeda, H., Abe, H. (1975). "Assessment of biological age by multiple regression analysis". J. Gerontol., 30, 422-434.

Farber J.L., Kyle M.E., Coleman J.B., Mechanisms of cell injury by activated oxygen species, Lab. Invest., Volume: 62, (1990), pp. 670-679

Grossi E., Colombo R., Cavuto S., Franzini, C. (2005). "The REALAB project: a new method for the formulation of reference intervals based on current data", Clin Chem, 51(7):1232-40.

Grossi E., Colombo R., Cavuto S., Franzini, C. (2006). "Age and gender relationships of serum alanine aminotransferase values in healthy subjects", Am J Gastroenterol, 101(7):1675-6.

Hofeker, G., Skalicky, M., Kment, A., Niedermuller, H. (1980). "Models of biological age of the rats. I. A factor model of age parameter", Mech. Ageing Dev., 14: 335-359.

Hollingsworth, J. W., Hashizume, A., Jablon, S. (1965). Correlations between tests of aging in Hiroshima subjects - an attempt to define "physiological age", Yale J Med, 38, 11-26.

Jackson, S.H.D., Weale, M.R., Weale, R.A. (2003), "Biological age - what is it and can it be measured", Arch. Gerontol. Geriatr., 36, 103-115.
Jalavisto, E., Makkonen, T. (1963). "On the assessment of biological age. II. A factorial study of aging in post-menopausal women", Ann Acad Sci Fenn Med, 101: 5-25.

Joreskog, K.G., Sorom, D. (1983). LISREL V: analysis of linear structural relationship by the method of maximum likelihood. Chicago, IL: International Educational Services.

Kallner A., Gustavsson E., Hending E. (2000). "Can age and sex related reference intervals be derived for non-healthy and non-diseased individuals from results of measurements in primary health care?", Clin Chem Lab Med, 38:633-54.

Livi Bacci, M. (1999). Introduzione alla demografia, III edizione, Loescher, Milano.

Locatelli. I. (1999). L'evoluzione della mortalità dei grandi anziani in Italia in base al metodo delle generazioni estinte : applicazione di un modello età-periodo-coorte. Università Bocconi, Istituto di metodi quantitativi, Milano.

Nakamura, E. (1991). "A study on the basic nature of human biological aging process based upon hierarchical factor solutionof the age-related physiological variables", Mech. Ageing Dev., 60:153-170.

Nakamura, E., Miyao, K. (2003). "Further evaluation of the basic nature of the human biological aging based on a factor analysis of age-related physiological variables", J Gerontol Biol Sci, vol. 58A, 3:196-204.

Nakamura, E., Miyao, K., Ozeki. T. (1988). "Assessment of biological age by principal component analysis", Mech. Ageing Dev., 46:1-18.

Nette, E.G., Xi, Y.P., Sun, Y.K., Andrews, A.D., King, D.W. (1984). "A correlation between aging and DNA repair in human epidermal cells", Mech. Ageing Dev., 24, 283-292.

PetitClerc, C., Solberg, H.E. (1987). "Approved recommendation (1987) on the theory of reference values. Part 2. Selection of individuals for the production of reference values", J Clin Chem Clin Biochem, 25:639-44.

Richter, C. (1995). "Oxidative damage to mitochondrial DNA and its relationship to aging". In: Esser, K., Martin, G.M (eds), Molecular aspects of aging. Wiley, New York, p. 106.

Rivnay, R., Bergman, S., Shinitzky, M., Globerson, A. (1980). "Correlations between membrane viscosity, serum cholesterol, lymphocyte activity and aging in man", Mech. Ageing Dev., 12, 119-126.

Schapire, R. (1990). "The strength of weak learnability". Machine Learning, 5:197-227.

Schumann G., Klauke R. (2003), "New IFCC reference procedure for the determination of catalytic activity concentrations of five enzymes in serum: preliminary upper reference limits obtained in hospitalized subjects", Clin Chim Acta, 327:69-79.

Vincent. P. (1951). "La mortalité des vieillards", Population, VI, 2, 181-204.

Weale, R.A. (1997). "Human biological decline and mortality rates", Mech. Ageing. Dev., 97, 55-72.